新闻资讯

产品线涵盖分子生物、细胞培养、样品处理、微生物学、样品冻存、免疫检测、核酸提取、蛋白纯化、食品检测等方面,为客户提供品质产品及专业技术服务。

磁珠对PCR抑制原因与解决方案
来源: | 作者:muchen | 发布时间: 2021-08-05 | 75 次浏览 | 分享到:
随着精准医疗的发展以及二代测序成本的降低,分子诊断的市场需求逐年上升。磁珠作为分子诊断中核酸提取、探针捕获等实验的重要原材料,为其实现高回收率、自动化发挥了重要的作用。

然而不同实验的洗脱效率对最终核酸分子的回收率有很大的影响(Tips:尤其在探针捕获领域)。因此,为降低洗脱不完全以及洗脱试剂造成的污染,将捕获了核酸的磁珠直接进行PCR扩增,成为越来越多分子诊断与测序中常用的实验手段。也行有不少研究者发现,带磁珠进行PCR扩增,会对PCR产生抑制作用,Dr. BEAVER这次为大家验证了磁珠抑制PCR的原因,以及解决方案。

随着精准医疗的发展以及二代测序成本的降低,分子诊断的市场需求逐年上升。磁珠作为分子诊断中核酸提取、探针捕获等实验的重要原材料,为其实现高回收率、自动化发挥了重要的作用。

然而不同实验的洗脱效率对最终核酸分子的回收率有很大的影响(Tips:尤其在探针捕获领域)。因此,为降低洗脱不完全以及洗脱试剂造成的污染,将捕获了核酸的磁珠直接进行PCR扩增,成为越来越多分子诊断与测序中常用的实验手段。也行有不少研究者发现,带磁珠进行PCR扩增,会对PCR产生抑制作用,Dr. BEAVER这次为大家验证了磁珠抑制PCR的原因,以及解决方案。

那磁珠抑制PCR的可能性因素有哪些呢?

1.磁珠品牌;
2.磁珠使用量;
3.磁珠Fe离子泄露;
4.磁珠表面材质及电荷的影响;
此研究还有很多需要改进的地方,大家可在下方留言,共同探讨。

不同品牌的SA磁珠对PCR的影响
我们选用了进口磁珠以及两种品牌的国产链霉亲和素磁珠(SA磁珠)验证其对PCR的影响。结果出乎意料,进口T1磁珠对PCR的抑制效果最为明显。SA-1磁珠对PCR的影响强于SA-2磁珠。

图1.不同品牌的磁珠(1 mg beads/50μL PCR)均对PCR具有不同程度的抑制。

不同浓度的SA磁珠对PCR抑制效果
为了验证不同磁珠使用量对PCR的抑制情况,我们选用了两种SA磁珠,控制PCR体系中SA磁珠的浓度。结果显示,低浓度磁珠对PCR的抑制很少,甚至可略微增强PCR反应效率,但随着磁珠浓度增加,对PCR抑制作用显著上升。当磁珠浓度达到0.5mg/50μL PCR时,抑制作用开始明显,SA-1磁珠对PCR的影响强于SA-2磁珠(与上述结论相同)。

图2:两种不同浓度的SA磁珠投入PCR体系中,PCR产物的电泳图。

Fe离子泄露对PCR的抑制作用
资料报道10μM 以上浓度的Fe离子会强烈抑制PCR。若磁珠在PCR过程中有铁离子的渗出,则会导致对PCR的抑制。上述实验表明1mg/50μL PCR的磁珠均会对PCR产生抑制。但Fe离子泄露实验证明SA-2磁珠无Fe离子泄露,但仍然会抑制PCR反应。

图3:采用邻菲啰啉法检测检测2种SA磁珠在PCR产物中Fe离子的浓度。

不同表面材质及电荷的磁珠对PCR的抑制效果
本次实验我们选用2种不同表面的磁珠,其中一款为二氧化硅羟基表面。另外一款为聚合物羧基表面。两种磁珠在PCR体系中均无Fe离子泄露,但都对PCR产生抑制,其中二氧化硅羟基磁珠更为明显。

图4:相同浓度二氧化硅羟基磁珠以及聚合物羧基磁珠(1mg beads/50μL PCR)PCR之后的产物电泳图。

图5:两种磁珠在PCR体系中均无Fe离子泄露。磁珠抑制作用与漏铁无明显相关性。磁珠对PCR的抑制原因,更有可能是其表面材质(或电荷)对PCR有抑制作用。

磁珠对PCR抑制解决方案:
总而言之,对PCR体系抑制是绝大部分的磁珠都存在的现象。海狸研发团队为了解决以上问题,配合磁珠试剂,开发了一款能够消除磁珠对PCR影响的PCR增强试剂,能够明显降低磁珠对PCR的影响。


图6.control为正常PCR产物,1、2、3、4为PCR体系中添加4种不同磁珠的PCR产物。1、2、3、4-Enhancer是在PCR体系中加入以上4中磁珠及4μL的增强试剂后PCR产物。


​新闻分类
热门资讯
  • 暂无相关记录!